Nature Medicine:改良基因编辑方法可高精度治疗“贝多芬小鼠”的遗传性耳聋

测序中国 2019/07/14 23:33

新知图谱, Nature Medicine:改良基因编辑方法可高精度治疗“贝多芬小鼠”的遗传性耳聋

科学家在基因编辑治疗遗传性病中的应用已经进行了长时间的探索。 2017年12月,Broad研究所David Liu教授研究团队使用CRISPR-Cas9基因编辑技术,成功敲除了贝多芬小鼠的 Tmc1 基因突变,减少了小鼠的听力损失,为遗传性耳聋的基因治疗奠定了基础。 同时,该研究还实现了将CRISPR-Cas9技术所需的蛋白质和RNA转移到活体动物的细胞中。

由于人类大多数显性突变是单核苷酸突变,理想的基因编辑治疗是在不影响野生型等位基因的前提下,有效且选择性地修正这些显性突变。 但单核苷酸突变很难识别,正常内切酶可导致多种错误切割,如化脓性链球菌Cas9(SpCas9)能够耐受目标DNA与gRNA的7种错配。 此外,一些Cas9酶中的前间区序列邻近基序(PAM)也可耐受与靶DNA的错配。

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为了克服以上限制,来自美国、瑞士和波兰的科学家组成研究团队,共同优化了CRISPR-Cas9基因编辑系统。 新的基因编辑系统可准确识别、切割贝多芬小鼠中导致听力丧失的基因突变,同时不产生任何明显的脱靶,极大地提高了基因编辑技术的功效和安全性。 近日,相关研究成果发表在 Nature Medicine 上。

该研究团队在14个Cas9/gRNA组合中进行了筛选,以确定能够有效识别并切割特异性单核苷酸变异的组合。 通过试验,研究人员鉴定了 金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9-KKH)的PAM变体 ,并将其与可确定靶基因位置的gRNA结合,开发了新的基因编辑系统。 该系统 可在DFNA36人细胞系中选择性并有效地切割 Tmc1 突变,且不破坏野生型等位基因。

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图: 研究中使用的AAV载体示意图。

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图: 体内研究实验概述。

同时,研究团队构建了贝多芬小鼠模型,使其 Tmc1 基因发生点突变。 Tmc1 是听觉的必须基因 ,其在耳蜗内、外毛细胞中的表达与维持毛细胞的正常功能密切相关。 研究结果显示,在注射腺相关病毒(AAV)介导的SaCas9-KKH基因编辑系统后,贝多芬小鼠可以在一年内避免耳聋的发生。 对目前的ClinVar分析表明,有21%的人类显性突变可以使用类似的方法进行定位。

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图: 24周时,4个未注射(上)和6个注射治疗 Tmc1 Bth / WT小鼠(下)的8、16和32kHz区域100-μm耳蜗切片的共聚焦图像。 MYO7A(红色),肌动蛋白(绿色)。

研究团队仔细观察了小鼠的内耳毛细胞, 发现在未经治疗的贝多芬小鼠中,毛细胞随着结构的恶化逐渐消失。 与之相比,接受治疗的小鼠保留了正常数量的毛细胞,结构比较完整。 为进一步检验基因编辑治疗的效果,研究人员在不同声音强度下检查了小鼠大脑脑电波的反应,该方法通常用于新生儿听力筛查。

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图: 未注射健康小鼠 Tmc1 WT / WT(左)、未注射贝多芬小鼠 Tmc1 Bth / WT(中)和注射治疗贝多芬小鼠 Tmc1 Bth / WT(右)的耳蜗毛细胞SEM图。

此外,研究人员发现,在不干预的情况下,贝多芬小鼠在1个月大时对高频声音的反应就开始降低,6个月左右完全失聪。 在出生不久就接受基因编辑治疗的小鼠中,2个月小鼠的听力与健康小鼠的听力几乎无差别。 6个月的小鼠仍可保持对低频声音的正常听力。 部分小鼠,在接受治疗后的近一年里可保持稳定的听力。 值得关注的是,DNA分析结果显示, 基因编辑仅发生在具有 Tmc1 突变的小鼠内耳细胞中。 在接受注射但没有突变的小鼠中没有检测到编辑变化,且没有听力损失,表明该基因编辑方法具有极高的精确度。

除了遗传性耳聋,基因编辑在其他疾病治疗研究中也发挥了重要作用。 2017年12月,美国FDA批准了Spark公司AAV基因疗法,通过AAV病毒载体将正确的RPE65基因递送到视网膜细胞,从而治疗Leber先天性黑蒙2型。 2019年1月,Editas Medicine公司发表研究称,其开发的编号为EDIT-101的CRISPR/Cas9基因疗法,可恢复Leber先天性黑蒙症10型的视力。 2019年7月2日, Nature Communications 发文,科学家利用CRISPR基因编辑技术结合新开发的抗逆转录病毒疗法(ART),成功地为30%的感染小鼠消除了HIV DNA,并有望进行人体临床试验。

虽然该最新研究中的基因编辑方法可高精度的编辑小鼠体内的基因突变,但在用于人体之前,还有许多研究工作要做。 该研究极大地提高了基因编辑技术的功效和安全性,为精确治疗由单个基因拷贝突变引起的显性遗传疾病奠定了基础。

参考资料:

1. Bence György et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine, 2019, doi:10.1038/s41591-019-0500-9.

https://www.nature.com/articles/s41591-019-0500-9

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