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《自然》:重磅基因编辑工具诞生,填补最后一个角落,首次实现线粒体基因编辑

精准医学前沿 | 科普评论医学健康前沿亮点研究 2020/07/12 17:15

新知达人, 《自然》:重磅基因编辑工具诞生,填补最后一个角落,首次实现线粒体基因编辑

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基因编辑,又称基因组编辑或基因组工程,是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。 基因编辑技术指能够让人类对目标基因 进行定点“编辑”,实现对特定DNA片段的修饰。 但目前基因编辑只能对核基因组进行编辑,并未能实现对线粒体基因组进行编辑


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近日,来自华盛顿大学的Joseph Mougous教授与Broad研究所的刘如谦(David Liu)教授团队合作,在国际顶级期刊《自然》(Nature)在线发表了一篇基因编辑的重要论文, 开发出国际上首个能够实现线粒体DNA精确编辑的分子工具系统,填补了基因编辑的最后一个角落


这项研究成果一经发表,迅速引起业内广泛关注和认可点赞 。国际顶尖学术期刊《自然》(Nature)和《科学》(Science)等均发表特刊介绍这项工作。


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国际上研究线粒体疾病的权威专家评论道:“ 这项研究用“非常巧妙的策略解决了线粒体领域的‘圣杯’问题 ”。


线粒体是细胞内的能量工厂,也是细胞内除细胞核以外,还有基因组的细胞器。虽然线粒体基因组( 线粒体DNA,MtDNA) 只编码了13种蛋白质,但所有这些蛋白质都参与了细胞能量供应的产生。


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线粒体结构


线粒体病是遗传缺损引起线粒体代谢酶缺陷,致使ATP合成障碍、能量来源不足导致的一组异质性病变。线粒体脑肌病的不同类型发病年龄不同。线粒体是密切与能量代谢相关的细胞器,无论是细胞的成活(氧化磷酸化)和细胞死亡(凋亡)均与线粒体功能有关,特别是呼吸链的氧化磷酸化异常与许多人类疾病有关。


线粒体DNA(MtDNA)突变可导致一系列无法治愈的、限制生命的代谢性疾病。因此,开发编辑纠正线粒体DNA变异的工具是线粒体遗传学长期追求的目标。


近日,Mok等人在国际顶级期刊“自然”(Nature)杂志上撰文称,他们首次使用了一种分子工具,可以对线粒体DNA进行精确编辑。


这一成就的关键是发现了一种由细菌分泌的毒素,可以杀死邻近的细菌。 Mok等人发现的这种细菌分泌的毒素,居然是一种被称为DddA的胞苷脱氨酶,它催化核苷酸碱基胞嘧啶(C)转化为另一个碱基尿嘧啶(U) 。DddA的一个显著特征是它以双链DNA为靶标,而所有先前发现的3种胞苷脱氨酶都以单链DNA为靶标。


至关重要的是,尽管传统的基因组编辑方法涉及到核酸酶,这些酶充当分子剪刀来切割两条链上的DNA,但DddA 胞苷脱氨酶 将C转化为U,而不会导致双链DNA断裂, 这使得 DddA 胞苷脱氨酶 特别适合于编辑线粒体基因组,因为线粒体基因组缺乏修复双链DNA断裂的有效机制


研究人员必须克服几个挑战,才能将DddA重新用于线粒体基因组编辑。其中最主要的是胞苷脱氨酶对哺乳动物细胞的毒性。Mok 等人将DddA的毒素结构域分成两个不活跃的部分,称为Split-DddAtox Halves。他们将这两个部分融合成TALE蛋白,这些蛋白可以被改造成与特定的DNA序列结合。这两个故事与线粒体DNA的结合使分裂的DddAtox一半聚集在一起,并因此激活。


为了到达线粒体基质中的mtDNA,TALL-Split-DddAtox必须穿过两个线粒体膜。因此,Mok和他的同事用一个氨基酸序列标记了这个结构,这个氨基酸序列起到了线粒体靶向信号的作用。 与RNA引导的基因组编辑系统(如CRISPR-Cas9)相比,利用现有蛋白质导入机制的能力使这种方法具有重大优势 CRISPR方法不能有效地处理线粒体DNA,可能是因为细胞没有将RNA导入线粒体的机制


另一个挑战来自胞苷脱氨酶将C转化为U,而不是DNA特异的碱基胸腺嘧啶(T)。虽然U与T具有相同的碱基配对性质,但它属于RNA。碱基通常是在一种叫做尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶的帮助下从DNA上切割出来的,并用C。


因此, Mok 等人将TALL-Split-DddAtox的一半与尿嘧啶糖化酶抑制剂(UGI)融合在一起。这保护U不受糖基化酶的影响,直到下一轮DNA复制或修复发生,此时来自互补链的鸟嘌呤(G)碱基-在编辑前与C配对-被腺嘌呤(A)取代,腺嘌呤(A)是与T配对的碱基。UGI的并入使胞嘧啶碱基编辑的效率提高了约8倍。


因此,最后的结构被称为DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器(DdCBE)系统,由线粒体靶向信号、蛋白、分裂的DddAtox一半和UGI组成 (图1)。 Mok等人进一步证明该构建物可以有效地导入到人类细胞的线粒体中,并可以修正一系列的线粒体基因突变 。从C-G碱基对到T-A的编辑大约发生了5-50%的时间。编辑效率受到各种因素的影响:两个DdCBE亚基之间的间距;TALE设计;Split-DddAtox一半的方向;以及靶细胞胞嘧啶相对于TALE结合位点的位置。


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图1|纠正线粒体基因组的工具 。Mok等人开发了一种名为DdCBE的分子工具,可以将细胞DNA中胞嘧啶和鸟嘌呤(C-G)的碱基对改变为胸腺嘧啶和腺嘌呤(T-A)对,称为线粒体。在作者的方法中,DdCBE最初被分为两个构建体,每个构建体都包含:细菌毒素的一个非活性部分,称为Split DddAtox;一个与特定线粒体DNA序列结合的故事蛋白;一个针对线粒体基质的氨基酸序列;以及一个尿嘧啶糖基酶抑制剂(UGI)蛋白。b,当将构建体导入线粒体基质时,线粒体靶向序列丢失。TALL蛋白与相邻的线粒体DNA序列结合,聚集在一起,从而激活了两个分裂的DddAtox一半。这种毒素作为一种酶,将目标C碱基转化为另一种碱基,尿嘧啶(U)。通常情况下,U会从DNA中去除,但UGI蛋白会保护编辑过的碱基,直到DNA复制发生(未显示)。在这一点上,它被T替换,T与A形成一对。


DdCBE基因编辑系统脱靶效应如何?


所有基因组编辑工具的一个主要考虑因素是它们是否修改了非预期位点的DNA。 Mok和他的同事比较了处理和未处理的细胞,在核基因组中没有发现脱靶效应,只在一个线粒体的基因上发现存在很低的脱靶效应


接下来, Mok 等人。检测DdCBE基因编辑系统的治疗潜力。作者报告说, DdCBE基因编辑系统 有可能纠正49%的已知有害mtDNA突变 。然而,在目前的形式下,DdCBE只能有效地编辑基因组中前面有T的C碱基,从而缩小了它的范围。


DdCBE依赖DNA复制来实现C-G到T-A转换,这意味着理论上最高编辑效率为50%。为了解释这两个新复制的mtDNA,每个新复制的mtDNA都会收到一个亲本DNA链,其中一个将未经编辑,包含G,它与C配对。


然而,Mok等人 发现DdCBE的活动持续了几天,有可能在后续复制事件期间提供进一步编辑的机会 。在长期接触DdCBE期间,基因编辑的脱靶效应是否会增加,将是未来的一个关键考虑因素。


这些警告意味着DdCBE可能导致mtDNA突变的减少,而不是完全消除。但鉴于mtDNA疾病症状的严重程度随着突变负荷的增加而增加,降低突变水平的能力本身就具有治疗希望。


线粒体靶向核酸酶以前已经被用来编辑纠正小鼠中特定的mtDNA突变。这是可能的,因为它们造成的双链断裂导致mtDNA降解。细胞含有许多mtDNA拷贝,只有携带有害突变的拷贝才会降解。


但在高突变负荷的情况下,消除突变的mtDNA可能会将mtDNA拷贝数降低到有害的低水平,这是有风险的。如果线粒体DNA的所有拷贝都携带相同的突变,则不能使用核酸酶方法。


相比之下,碱基编辑可以减少携带突变的mtDNA的比例,而不会减少拷贝数。因此,当突变负载较高时,这可能是首选(或唯一)选项。


DdCBE基因编辑系统有没有可能阻止mtDNA疾病的传播?


mtDNA通常只从母亲那里遗传,目前的线粒体替换程序通过将携带突变mtDNA的女性卵子的核基因组移植到未受影响的捐赠者卵子中来减少mtDNA突变的传播。理论上,碱基编辑以减少卵子或早期胚胎中的突变负荷可能是一种替代方法。然而,线粒体DNA复制被认为不会在人类发育的前五到六天发生,因此成功与否可能取决于尿嘧啶的长期保护作用。


Mok和他的同事的这项工作是开发线粒体DNA疾病基因疗法的关键进展。此外,通过使用该工具对线粒体基因组进行实验改变,我们可以更好地理解mtDNA突变与复杂疾病、癌症和与年龄相关的细胞功能障碍的相关性。


这项研究也可能激励蛋白质工程和进化的进一步发展,从而增加DdCBE基因编辑系统的范围和效率,并加强对其他有前途的候选碱基编辑的搜索。


参考文献:

https://www.nature.com/articles/d41586-020-01974-6


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